2024-12
?
反相高效液相色譜（RP-HPLC）是醫(yī)藥、食品、環(huán)保等行業(yè)中應用最廣泛的一種分析方法，具有分離效率高，選擇性好，靈敏度高等特點。
反相高效液相色譜分析方法開發(fā)過程中，固定相和流動相的選擇決定著方法的分離效果。目前，色譜柱填料純度和種類、色譜柱規(guī)格及填充工藝均日益改進，為分析工作者提供了更豐富的硬件選擇。流動相的選擇包括有機相的種類、混合比例、添加劑和pH值等，選擇合適的流動相對于液相色譜的分析至關重要。
在分析方法開發(fā)或使用過程中，流動相添加劑選擇或使用不當，不僅會導致分離效果不達預期，甚至可能導致色譜柱或儀器的損壞，因此，流動相的正確選擇是分析工作者必須具備的基本功。本文就流動相中添加劑的選擇和使用注意事項進行簡要分享，以期為分析工作者提供借鑒。
?
反相流動相中的常見添加劑
在涉及到藥物分析時，由于大多數(shù)藥物是可電離的，即酸性、堿性或兩性離子。一般情況下需要通過在水中加入pH調節(jié)劑、緩沖鹽等添加劑，抑制樣品組分解離或與待測組分“結合”，從而實現(xiàn)組分合理保留并擁有良好峰型的目的。
常見的流動相添加劑包括有磷酸鹽緩沖液、銨鹽緩沖液、三氟乙酸、三乙胺、離子對試劑等，具體見表1。
*在截止波長附近或以下的波長進行操作時，會由于溶劑的吸光度而增加基線噪音。最適用的流動相是在選定檢測波長處無背景吸收的流動相。使用這種流動相，可確保任何吸光度只和樣品有關。[1]
本文將針對幾類常用且使用過程中需要特別注意的添加劑簡要介紹如下，并對緩沖鹽濃度的選擇給出建議。
?
一、三乙胺的作用原理和合理使用
1.作用原理
色譜柱鍵合相上殘留的硅羥基容易與堿性化合物結合而造成峰脫尾，在流動相中加入堿性的三乙胺后，三乙胺與硅羥基結合，從而阻礙了樣品中堿性化合物與硅羥基的作用，可以減少峰拖尾。
2.使用注意事項
1）三乙胺的堿性很強，建議不要單獨使用，最好與其它試劑組成緩沖體系，并在加入三乙胺后調節(jié)pH值至目標值。一般用量在流動相體積的0.1%~0.3%。
2）三乙胺截止波長較高，液相方法中的檢測波長在低波長端時需要謹慎使用。
?
二、離子對試劑的作用原理和合理使用
1.作用原理
使用反相色譜法分析電離能力比較強的樣品時，樣品組分在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應的離子對試劑，它可以與待分析的組分結合成離子對而呈中性，疏水性增加而在色譜柱上有保留行為。離子對類似于膠黏劑，一端以離子吸引住待測組分，另一端以碳鏈與固定相作用，從而把待測組分保持在固定相上。
若分析物為強堿性化合物，通常會在流動相中添加烷基磺酸鹽離子對試劑，如戊烷磺酸鈉；若分析物為強酸性化合物，通常流動相中會添加四烷基銨鹽或烷烴銨鹽離子對試劑，如四丁基溴化銨。經(jīng)過長時間的色譜柱平衡，流動相中離子對試劑的疏水端（烷基部分），與固定相長鏈強力吸引；親水端（磺酸陰離子或氮正離子）則暴露于固定相與流動相的相界面上。當被分析離子化合物進入色譜柱時，強堿性化合物/強酸性化合物與相界面上的磺酸陰離子/氮正離子產(chǎn)生靜電作用，從而產(chǎn)生保留。
2.離子對流動相pH要求[3]
考慮到烷烴磺酸pKa約為1，強堿性化合物pKa約為9，為保證烷烴磺酸與強堿化合物均完全離子化，流動相的pKa應偏離二者的pKa至少2個單位，故在用離子對色譜法分析強堿性化合物時，流動相的pH應在3~7的范圍。考慮到四烷基銨鹽或烷烴銨鹽pKa約為10，強酸性化合物pKa約為2，同理可得，當在用離子對色譜法分析強酸性化合物時，流動相的pH應在4~8的范圍?？蛇x的緩沖鹽有磷酸鹽（pKa3.2&7.2）、甲酸鹽（pKa3.8）、乙酸鹽（pKa4.7）。如若要在同一個分析方法中同時實現(xiàn)強酸與強堿化合物的保留時，可在流動相中同時添加烷基磺酸鹽離子對試劑以及四烷基銨鹽或烷烴銨鹽離子對試劑，同時維持流動相的pH在4~7即可。
3.使用注意事項
1）當使用的離子對試劑疏水性較強（如烷基磺酸鹽）或季銨鹽試劑（如四丁基銨）時，柱平衡通常較慢，需要注意基線穩(wěn)定性和保留值重現(xiàn)性。
2）若發(fā)現(xiàn)選擇的離子對試劑不合適而想換一種離子對試劑時，如果不更換色譜柱，最好先充分清洗原來色譜柱中的離子對試劑，再用新流動相平衡色譜柱。不同的離子對試劑有不同的清洗方法：
對于陰離子試劑：用50%~80%的甲醇-水清洗；
對于季銨鹽類試劑：用50%甲醇-緩沖劑（100~200 mM）（如pH4~5，100mM磷酸鉀）清洗，其中加入磷酸鉀的目的是降低試劑銨基與硅羥基發(fā)生作用。
3）離子對試劑對色譜柱的影響
如果使用的離子對試劑疏水性非常強，那么它會在固定相上產(chǎn)生持久的保留，對色譜柱產(chǎn)生不可逆的的改性。因此需要專柱專用，特別在開發(fā)新方法的時候，不要使用這種被改性過的柱子，不然可能在使用新柱子時不能重現(xiàn)原來的結果。
?
三、離液鹽試劑的作用原理及應用
離液鹽試劑，常用的有高氯酸根離子、三氟乙酸跟離子、四氟硼酸根離子以及六氟磷酸根離子，主要應用于堿性質子化合物分析。
1.作用原理
隨著色譜柱平衡，固定相疏水表面會富集形成親脂的有機相層（如甲醇、乙腈），親脂的離液陰離子會在有機相界面富集，形成具有陽離子交換性質的“偽固定相”層。當被分析的堿性質子化合物進入色譜柱時，離液陰離子會破壞分析物的溶劑化分子層，通過靜電作用，形成“堿質子化合物-離液陰離子”中性化合物，從而產(chǎn)生或增強保留。[3]
2.應用品種
中國藥典二部2020年版項下的左氧氟沙星、鹽酸丙米嗪、雷米普利等堿性化合物品種均在流動相中加入了高氯酸鈉。
?
四、無機鹽類添加劑的使用濃度要求
1.無機鹽添加劑的析出風險
當流動相為有機物和含鹽緩沖液時，隨著有機物比例增加，會使無機鹽溶解度降低，當有機物比例超過一定數(shù)值時，無機鹽就會析出。緩沖鹽溶液在HPLC泵頭內極易出現(xiàn)高壓鹽析現(xiàn)象，磨損密封墊，所以一般將緩沖鹽濃度選定在5mM～50mM。
在藥品有關物質分析方法中，經(jīng)常使用梯度洗脫，程序后段為有機相比例較高的強洗脫，以保證所有成分充分洗脫，此時需要注意有機相最高比例，避免緩沖鹽析出，以保護色譜柱。
另外，隨著有機相比例的升高，流動相的pH值也會相應上升，當超過色譜柱允許的pH值范圍，會導致柱內硅膠溶解而損壞色譜。[5]
2.無機鹽添加劑的使用濃度安全范圍
緩沖鹽的濃度和有機相比例的確定，需要綜合分離效果、鹽析風險、pH影響來進行選擇，必要時進行柱外模擬實驗，也可借鑒已有法定方法進行評估。
本文以磷酸二氫鉀緩沖鹽為例，對中國藥典二部2020年版項下的化學藥品種進行了篩選，將流動相中“磷酸二氫鉀濃度大于20mM”且“有機相比例大于35%”的典型品種列舉如下，為緩沖鹽的析出風險安全范圍提供一定數(shù)據(jù)參考。
?
?
參考資料：
[1] Waters：Alliance iS HPLC Systems 用戶指南
[2] HPLC and UHPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, 2019
[3] 淺談RP-HPLC中離子對試劑與離液劑的異同及應用 藥事縱橫 2022
[4] 《中國藥典》2020年版 二部
[5] 含鹽流動相損壞色譜柱原因探討 章志青 山東化工 2009
